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原副标题：天根鼠法mRNA抽取操作方法

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目的：

建立焦油/美味组织机构总RNA抽取要领。

范围：

适用焦油/美味组织机构总RNA抽取的操作。

职责：

研发微生物医学负责人负责维护本制度的精que性和执行科学性，并对RNA抽取的质量进行监督。

内容：

实验前中间体材料准备与检查和工作如下：

1. RNA抽取鼠（天根；冷藏置放）乙烯液RLRNase-Free DNase I消液(天根；保存
2. 在2-8℃)

AgNO；

1. β-乙酸铵RNase-free高速旋转杀菌的1.5ml EP管；RNase-free高速旋转杀菌的各类移液刀柄；RNase-free水。

图1：天根抽取鼠

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操作方法

第一部份:组织机构前处置：

1. 焦油组织机构前处置：取1ml丙烯放于1.5ml EP混合气体，用混合气体丙烯电烧浸液，在湿润时用小刀镰形焦油组织机构至EP混合气体，共镰形4至8片焦油浸液(或切取2-8片5-15 µm厚的焦油切碎)，不超过8片；

图2：焦油浸液组织机构样品处置

图3：焦油cccDNA组织机构样品处置

1. 盘整搅匀器上强而有力共振20s，18000rpm常压Masevaux3min，用高浓度移液管除去上清，留神千万别拆走结晶的组织机构块(可以适情况多次重复上面关键步骤一次)；加1mlAgNO至EP管，盘整搅匀后，18000rpm常压Masevaux3min，除去上清，留神千万别拆走结晶的组织机构块；打开管盖，37℃蒸发5-10min(或至尼古丁均已蒸发无尼古丁味)；美味组织机构前处置：

采用纸制的小刀或小刀将美味组织机构块（10-20mg）在含有300μl乙烯液RL（使用前检查和是否重新加入1%的β-乙酸铵）的杀菌1.5mLEP混合气体拆分成新组织机构块（尽量减碎）。

第二部份：组织机构吸收：

1. 焦油组织机构吸收：重新加入200ul乙烯液RF 以及10ul酵素K 于结晶中，彻底喷流搅匀；55℃坎氏30～60 min 之后80℃坎氏15 min。美味组织机构吸收：重新加入590ulRNase-Free ddH2O和10ul酵素K于结晶中，搅匀后56℃处置60min。

图4：组织机构吸收

第三部份：RNA粘附

1. 常压(20-25℃)，12,000 rpm(～13,400×g)Masevaux5 min，迁移上和信捷伊RNase-freeMasevaux混合气体；

图5：迁移上清

1. 焦油样品：重新加入220ul的碘化钾RB，喷流搅匀，重新加入660ul的AgNO；美味组织机构：缓慢重新加入0.5倍上清表面积AgNO。

图6：重新加入0.5倍上清表面积AgNO

1. 搅匀（此时可能出现结晶），迁移700μl水溶液和结晶一起转入粘附柱CR3中（粘附柱放在搜集混合气体），12,000 rpm(～13,400×g)Masevaux30～60 sec，弃掉搜集混合气体的煤焦油，将粘附柱放回搜集混合气体；

图7：氯化钠迁移

1. 多次重复上一关键步骤，直到所有的水溶液和结晶完全通过粘附柱CR3，弃煤焦油，将粘附柱CR3放回搜集混合气体。

第四部份：DNase吸收：

1. 向粘附柱CR3中重新加入350ul去蛋白液RW1，12,000 rpm(13,400×g)Masevaux30-60s，弃煤焦油，将粘附柱放回搜集混合气体。（对于美味组织机构，此关键步骤可以省去）；

图8：去蛋白液洗涤

1. DNase I储存液的配制：将DNase I消液溶解在500ul RNase-free水中，轻柔搅匀，分装（50ul/管）后-20℃储存（可保存9个月），每次按照实验要求取出。请注意将融化的DNase I的储存液放于4℃储存（可保周），请勿再次冻存；

加水

揭盖

轻柔搅匀

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分装

-20℃储存（可保存9个月）

图9：DNase储存液配制

1. DNase I工作液的配制：取50ulDNaseI储存液放入捷伊RNase-FreeMasevaux混合气体，重新加入350 ulRDD水溶液，轻柔搅匀；

图10：DNase工作液配置

1. 向粘附柱CR3 中央重新加入80ul的DNase I 工作液，常压置放15min；

图11：DNase常压吸收15min

第五部份：RNA洗脱

1. 向粘附柱CR3 中重新加入500ul去蛋白液RW1，常压(20~25℃)，12,000rpm(～13,400×g) Masevaux30-60s，弃煤焦油，将粘附柱放回搜集混合气体；向粘附柱CR3 中重新加入500ul漂洗液RW（使用前请先检查和是否已重新加入乙醇）， 常压静置2min，12,000 rpm(~13,400×g)Masevaux30-60s，弃煤焦油，将粘附柱CR3放回搜集混合气体；

漂洗液

图12：漂洗液RW洗涤

1. 多次重复上述关键步骤；常压(20~25℃)，12,000 rpm(~13,400×g)Masevaux2min，倒掉煤焦油。将粘附柱CR3放于常压置放数分钟，以彻底晾干粘附材料中残余的漂洗液。将粘附柱CR3 转入一个捷伊RNase-free Masevaux混合气体，向粘附膜的中间部位悬空滴加30-100ulRNase-free ddH2O，常压置放2min，12,000 rpm(~13,400×g)Masevaux2min，得到RNA 水溶液。在管壁和管盖上标清样品wei一性编号；将RNA用于后续操作或冻存在-80℃；及时做好纸质和电子文档记录。

第六部份 RNA质量检测

1. 完整性：琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。由于固定和cccDNA的条件限制，FFPE样品核酸通常发生片段化并且会被甲醛化学修饰，因此较难抽取，本鼠抽取的RNA可应用于RT-PCR等下游试验。

图13：漂洗液RW洗涤

该鼠能可从美味组织机构中快速抽取总RNA，可同时处置大量不同样品。抽取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他杂质污染。例如利用该鼠分离大鼠不同组织机构总RNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在7~15kb处，高分子RNA（mRNA和 hnRNA）呈不连续的带状分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有两条主要条带。

1. 纯度分析：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280 读数在1.8-2.1 之间，比值为2.0 是高质量RNA 的标志。OD260/OD280 读数受测定所用水溶液的pH 值影响。
2. 同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 水溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯.

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